Enzymatische Schnelltests zum Erhitzungsnachweis in Milch
Im folgenden Lernpaket sollen enzymatische Schnelltests zum Erhitzungsnachweis von Milch erlernt bzw. wiederholt werden.
| Fächer | Mikrobiologie und Biotechnologie |
| Erstellt von | Erich Ziegelwanger, HBLFA Francisco Josephinum Wieselburg |
| Zeitdauer | 2 UE |
| Schulstufen | 12. bis 13. Schulstufe |
| Kompetenzen | Die Schüler/innen sollen die Anwendung von enzymatischen Schnelltests bei erhitzter Milch verstehen und anderen Personen vermitteln können. Dazu sollen die beiden Enzyme alkalische Phosphatase und der Lactoperoxidase zum Nachweis einer erfolgreichen Wärmebehandlung von Milch angewendet werden. |
Nachweis von Enzymen
Zum Nachweis der erfolgreichen Wärmebehandlung von Milch wird routinemäßig die Enzymaktivität von zwei unterschiedlich hitzestabilen Enzymen, nämlich der Phosphatase bzw. der Peroxidase herangezogen.
Nachweis des Enzyms Phosphatase
Die alkalische Phosphatase ist ein in der Milch enthaltenes originäres Enzym, welches durch Spaltung der Phenylester der Phosphorsäure Phenol erzeugt. Dieses Phenol kann mit geeigneten Reagenzien durch eine Farbreaktion nachgewiesen werden. Da die alkalische Phosphatase ein sehr hitzelabiles Enzym ist, welches schon bei Temperaturen von ca. 60 °C irreversibel inaktiviert wird, kann sie als Nachweis einer ordnungsgemäß durchgeführten Pasteurisierung herangezogen werden indem nachgewiesen wird, dass die Phosphatase nicht mehr fähig ist aus Estern Phenol abzuspalten.
Zu diesem Nachweis wird das Produkt Lactognost® der Firma Heyl verwendet:
Lactognost ist ein Testkit zur qualitativen Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase in Milch, Molke, Rahm und Butter. Der Test ermöglicht die Prüfung der ausreichenden Pasteurisierung von Milch und ähnlichen Produkten bzw. den Nachweis von Rohmilch in pasteurisierter Milch.
Hierzu wurden in einem Reagenzglas jeweils 1 Tablette Lactognostreagenz I (Dinatriumphenylphosphat) als Substrat und eine Tablette Lactognostreagenz II (alkalischer Puffer), zum Erreichen des Wirkoptimums der Phosphatase von pH 9,0 - 9,6, in 10 ml auf 37 °C erwärmtem destilliertem Wasser aufgelöst. Direkt im Anschluss daran wird 1 ml der zu prüfenden Milch hinzu pipettiert, eine Stunde lang im Schüttelwasserbad bei einer Temperatur von 37 °C gehalten.
Nach Ablauf dieser Zeit wurde ein gestrichener Dosierlöffel Lactognostreagenz III (Dibrominonchlorid) als Phenol-Nachweisreagenz hinzugegeben, gut durchmischt und die Probe 10 Minuten lang stehen gelassen, anschließend nochmals gut durchmischt und nach weiteren 3-5 Minuten wurde die Probe auf Umfärbung auf blau untersucht.
Bei inaktivierter alkalischer Phosphatase zeigte sich eine rötlich-braune, allmählich in grau übergehende Färbung.
Nachweis des Enzyms Lactoperoxidase
Die Lactoperoxidase (LP) ist ein originärer Bestandteil der Milch mit antimikrobieller Wirkung. Die LP als Enyzmprotein setzt zusammen mit Wasserstoffperoxid und Thiocyanat, welche in der Rohmilch in unterschiedlicher Konzentration vorkommen, durch Katalyse der Oxidation von Wasserstoffperoxid Reaktionsprodukte frei, die bakeriostatisch bzw. bakterizid wirken. Sie setzt also katalytisch Sauerstoff aus Peroxiden um. Diese Reaktion kann mit einem einfachen Test nachgewiesen werden.
Die LP wird bei Erhitzung auf 85 °C für 4 Sekunden inaktiviert, wodurch sie als Nachweis für eine Temperaturbelastung oberhalb der normalen Pasteurisierung herangezogen werden kann.
In Anwesenheit von aktiver Lactoperoxidase setzte diese das farblose Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) in das Oxidationsprodukt Benzidinblau um, wodurch sich die Probe blau verfärbt. Der Farbumschlag kann qualitativ oder durch eine photometrische Untersuchung nachgewiesen werden.
Auswertung Peroxidase Test
Die Blaufärbung des Peroxidasetest ist eindeutig mit freiem Auge ersichtlich.
Die Proben b und c sind Peroxidase positiv, während die Proben a, d und e keinerlei Farbreaktion zeigen. Damit kann bei den beiden Proben b und c eine erfogte Hocherhitzung der Milch nachgewiesen werden.
ESL-, UHT- oder pasteurisierte Milch?
Die relative kurze Haltbarkeitsdauer von pasteurisierter Milch führte zur Entwicklung von ultra-hocherhitzter Milch(UHT-Milch), die mindestens 3 Monate oder länger ungeöffnet bei normaler Umgebungstemperatur haltbar ist, und aus diesem Grunde in vielen Ländern bereits hohe Akzeptanz erlangt hat (z.B. Frankreich, Deutschland, Portugal, Spanien). In anderen Ländern wiederum stehen die Konsumenten dieser Haltbarmilch wegen zum Teil sehr stark ausgeprägten Kochgeschmacks eher skeptisch gegenüber (z.B. Österreich, Griechenland, Irland, Niederlande, Großbritannien). In den letzten Jahren kann ein scheinbar unaufhaltbarer Trend in Richtung einer „neuen“ Konsummilchart festgestellt werden, die verlängerte Haltbarkeit bei gleichzeitig geringen negativen Begleiterscheinungen (wie z.B. Kochgeschmack, Vitaminverluste) bewirbt. Diese auf der Packung als „länger frisch“ bezeichnete sogenannte ESL-Milch (Extended Shelf Life) weist eine Haltbarkeit von mindestens 21 Tagen bei Kühlschrank-Temperaturen auf, wobei sensorisch im Vergleich zur herkömmlichen Frischmilch nahezu keine qualitativen Einbußen feststellbar sein sollen.
Ausführlichere Informationen zu diesem Thema finden sie in diesem Link.
Aufgabenstellung
1. Recherchiere im oben genannten Weblink mögliche Erhitzungsverfahren für UHT-, ESL- bzw. hocherhitzte und pasteurisierte Milch. Notiere dabei die Erhitzungszeit und die Erhitzungstemperatur dieser Technologien.
2. Vergleichen Sie UHT-, ESL- und pasteurisierte Milch mit den oben beschriebenen Erhitzungsmethoden und diskutiere die zu erwartenden Ergebnisse.